亓文寶:非瘟疫苗攻克難點究竟在哪?

發(fā)布時間:

2019/10/24

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非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的一種急性、出血性、高度接觸性、高死亡率的傳染病。從20世紀中期以來,已在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個國家流行,并在近幾年內(nèi)蔓延至歐亞兩洲接壤處的格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯及中國,給各國養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的危害,目前尚無有效的疫苗和藥物用來預防或治療該病。非洲豬瘟單克隆抗體具有特異性強、高效、靈敏、便捷、成本低等特點,單克隆抗體在非洲豬瘟病毒快速診斷技術(shù)研究、致病

  非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、熱性、出血性豬傳染病,急性感染死亡率為100%。急性和亞急性ASF常在多種器官上表現(xiàn)出嚴重的血管性病變,如腎臟出血、淋巴結(jié)彌漫性出血、肺水腫、脾臟充血性腫大、彌散性血管內(nèi)凝血和血小板減少等。其主要臨床癥狀是高熱、皮膚發(fā)紺、有出血點、嘔吐和便血等。因此,ASF被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的法定動物疫病之一,我國將其列為一類動物疫病。1921年,在非洲的肯尼亞地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)ASF。1957年,歐洲的葡萄牙第一次暴發(fā)ASF疫情,經(jīng)過一段時間沉默后,該病于1960年在歐洲的一些國家出現(xiàn)并逐漸傳播,2007年底進入俄羅斯。近年來東歐一些國家不斷發(fā)生疫情,國際疫情形勢十分嚴峻。2018年8月3日,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布了遼寧省出現(xiàn)我國首例ASF疫情。截至2019年5月13日,全國31個省(市、自治區(qū))和香港特別行政區(qū)先后出現(xiàn)130起疫情,給我國養(yǎng)豬行業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

  1.非洲豬瘟病毒的分類及結(jié)構(gòu)特征

  ASFV是一種有囊膜的單分子線狀雙鏈DNA病毒,屬于雙鏈DNA病毒目、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員,也是目前已知的唯一的蟲媒DNA病毒。家豬、野豬和軟蟬均為ASFV的宿主,豬單核細胞-巨噬細胞為ASFV主要的靶細胞。

  病毒基因組全長約為170-190 kb,基因組中間是一段長度約為125 kb的保守區(qū)。ASFV的基因組有150-167個開放閱讀框(ORFs),編碼150-200種蛋白質(zhì),其中約50種為結(jié)構(gòu)蛋白,主要結(jié)構(gòu)蛋白有p72、p54、p30、 p49、p220、p62和CD2v蛋白等。

  2.非洲豬瘟病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白

  p72蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,由B646L基因編碼。p72是病毒粒子二十面體衣殼的重要組成部分,產(chǎn)生于病毒感染的晚期,約占整個病毒粒子蛋白的32%。p72蛋白在非洲豬瘟病毒結(jié)合和進入受體細胞過程中有很重要的作用,并對病毒粒子衣殼的產(chǎn)生起著至關(guān)重要的作用[17]。非洲豬瘟病毒大多數(shù)毒株的毒力都很強,但是免疫原性很低,只有少數(shù)幾個蛋白具有免疫原性,有研究表明,不同區(qū)域ASFV毒株誘導產(chǎn)生的p72抗體的相應抗原表位都相當保守。p72蛋白的反應原性和抗原性很穩(wěn)定,病毒感染后能夠產(chǎn)生高滴度的抗p72抗體,常被用來作為血清學檢測和免疫制劑。p72參與了病毒的吸附過程,針對p72的抗體可以阻斷病毒與巨噬細胞的結(jié)合。因此非洲豬瘟單克隆抗體的制備主要是針對p72蛋白。

  p54蛋白同樣是非洲豬瘟病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白,由E183L基因編碼,蛋白分子中含有一段跨膜區(qū)域,主要集中于衍生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處。p54蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域?qū)Σ《镜鞍捉?jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成病毒包膜前體的過程十分重要,是非常重要的抗原蛋白。p54蛋白與細胞質(zhì)動力蛋白DLC8可發(fā)生特殊的交叉反應,介導病毒的細胞內(nèi)運輸,在細胞對病毒內(nèi)攝過程和病毒在細胞內(nèi)的加工過程中都起著重要作用。p54蛋白在非洲豬瘟病毒的感染早期能誘導caspase-9和caspase-3激活,激活細胞凋亡作用,進而誘發(fā)細胞吞噬,這是非洲豬瘟發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。

  p30蛋白是非洲豬瘟的一種膜蛋白,由CP204L基因編碼,在病毒感染早期表達,能夠引起機體產(chǎn)生免疫反應,因此該蛋白也具有比較好的抗原性,是一種重要的抗原蛋白。研究表明,針對p30蛋白的抗體能夠抑制病毒內(nèi)化,說明p30蛋白也參與病毒進入細胞的過程[25]。

  3.非洲豬瘟病毒的單克隆抗體研究

  由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體,稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備,雜交瘤抗體技術(shù)是在細胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上,將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。用具備這種特性的單個雜交瘤細胞培養(yǎng)成細胞群,可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆體。

  圖1.單克隆抗體制備過程

  非洲豬瘟單克隆抗體對非洲豬瘟病毒的快速診斷、致病機制、免疫機制和疫苗的研制有著重大的作用。非洲豬瘟單克隆抗體(ASFV McAb)一是用于免疫學相關(guān)ASFV檢測方法的建立,例如用于建立檢測ASFV抗原的直接免疫熒光試驗(DIF)、免疫酶組化試驗、夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗等;二是用于病毒和抗原結(jié)構(gòu)的研究及ASFV抗原特性的研究及疫苗的研制[26]。

  4.國內(nèi)外非洲豬瘟單克隆抗體研究進展

  單克隆抗體具有特異性強,敏感性高的特點,從而廣泛應用于對病毒及其特異性抗血清的免疫學鑒定。

  早在1984年,Sanz等人就首次制備了針對ASFV的單克隆抗體,獲得了241株穩(wěn)定的雜交瘤細胞,對其中90株(針對6個蛋白)進行了特異性試驗,對其中60株進行了分型。Garcia-Barreno等人于1986年發(fā)表于《Journal of Virology》上的論文,利用所制備的單抗(針對10個蛋白)識別ASFV抗原性的改變,鑒定了來源于非洲、歐洲和美洲不同ASFV毒株的抗原特性,并根據(jù)ASFV抗原性的不同對ASFV進行了分型[20]。Whyard等人于1985年制備了38株ASFV的單抗(針對5個蛋白),利用其中針對p72蛋白的單抗,建立免疫沉淀和免疫電鏡技術(shù),并對P72蛋白進行了深入研究。Zsak、Cobbold等人于20世紀90年代先后制備了針對P72蛋白的單抗;2018年 Mallory E. Heimerman等人利用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備了6株針對非洲豬瘟p72蛋白線性表位識別的單抗:mAb 85 (aa 165–171);mAbs 65-3 and 6H9-1 (aa 265–280);mAbs 8F7-3 and 23 (aa 280–294);and mAb 4A4 (aa 290–303)。

  國內(nèi)學者朱紅等于2007年利用大腸桿菌表達的不溶性融合蛋白GST-P72,免疫小鼠制備了5株分泌P72的單抗雜交瘤細胞,用其制備的單抗經(jīng)鑒定具有較好的特異性、穩(wěn)定性、敏感性及較強的生物學活性,并以此建立了相應的ELISA檢測方法;曹琛福等采用原核表達的重組蛋白p54制備所得單抗,對其抗原表位進行鑒定,發(fā)現(xiàn)第23-29位、第36-45位、第72-94位、第114-120位和第137-150位氨基酸為p54蛋白抗原位點,有較強的特異性和高親和性,這也一定程度上證明了通過基因工程技術(shù)獲得重組蛋白替代病毒作為抗原來源是可行的。

  5.展望

  近年來,國內(nèi)外運用基因工程技術(shù)獲得重組蛋白的方法變得越來越成熟、穩(wěn)定和有效,且利用原核表達系統(tǒng)(如大腸桿菌表達系統(tǒng))和真核表達系統(tǒng)(如桿狀病毒表達系統(tǒng))表達來獲得抗原也十分安全和快捷。通過眾多學者的研究,發(fā)現(xiàn)p72蛋白是ASFV主要的結(jié)構(gòu)蛋白,因此制備的單克隆抗體也主要針對p72蛋白。

  單克隆抗體的試驗周期較長,環(huán)節(jié)也多,所以失敗的概率也很高。目前國內(nèi)主要是針對p72蛋白來進行單克隆抗體的制備,也有針對較強抗原性的蛋白如p54和p30蛋白的單克隆抗體制備,但相對較少。如能在對P72蛋白深入研究的同時,對其他抗原性較強蛋白有更細致的研究,進一步制備出相應的單克隆抗體,將對ASFV實驗室診斷技術(shù)、致病機制、免疫機制和未來疫苗的研制產(chǎn)生積極的推動作用。

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